生物屆有一句名言——Western Blot是研究僧的勞斯萊斯。
Western Blot（蛋白印跡）雖然是科學研究中最為基礎平常的實驗，其背景里卻蘊含了很多知識，操作過程中也有許多trick，可以說“好的WB結果是順利畢業的一半”。
1.蛋白樣品制備——千萬別garbage in,garbage out
A: 蛋白提取：裂解要快速徹底，先變性后保存，在不影響后續實驗的情況下盡量選擇較強的裂解液 (RIPA裂解液)；蛋白提取要在低溫條件下進行，防止蛋白自溶或降解，同時可以加入適當的蛋白酶抑制劑以減少蛋白酶的水解作用。磷酸化蛋白提取還需加入蛋白磷酸酶抑制劑，以防止蛋白去磷酸化。
B: 蛋白定量：確定合適的上樣量，最常用的為BCA法 (BCA蛋白定量試劑盒)。
2.電泳SDS-PAGE——合適即完美
A: 制備上樣樣品：根據實驗要求，選擇變性/非變性上樣緩沖液，上樣前可以適當離心。
B: 配制聚丙烯酰胺凝膠：根據蛋白分子量的大小選擇合適的膠濃度，蛋白分子量小應選擇高濃度的膠，蛋白分子量大則選擇低濃度的膠；TEMED和APS促進凝膠反應，一般先加TEMED，后加APS；常溫下半小時膠可凝固，若天氣寒冷或需加快凝固，可將其置于37℃孵箱中加速凝固；膠最好現配現用，如果需要短暫保存，要用濕潤的保鮮膜包好并置于4℃冰箱中。
C: 配制電泳緩沖液：內槽電泳緩沖液要現配現用。
D: 根據蛋白分子量選擇合適的預染Marker。
E: 濃縮膠電壓一般采用100V左右，待溴酚藍遷移出濃縮膠后再換為200V。
3.轉膜——小手抖一抖，條帶變沒有
A: 膠在負極，膜靠近正極；為防止短路，濾紙不要大過膜【“三明治夾心”如圖示】，夾好膜和凝膠后，確保凝膠、膜和濾紙之間無氣泡，否則會導致轉膜不完全。
B: 轉膜緩沖液要提前冷卻，且膠要在轉膜緩沖液里平衡一下，防止膠變形，同時有助于去除影響轉膜的雜質；轉膜全程帶手套操作，避免手印污染影響結果；膜上可以剪一個小角用來標記正反面。
C: 濕轉法轉膜的電流一般在200-400mA之間，轉膜時間為30-60分鐘，也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據蛋白的分子量大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，分子量越小則需要的轉膜時間越短。
D: 可使用麗春紅染色液初步檢測轉膜效率，它與下游WB檢測完全兼容，無任何干擾。染色后可以用蒸餾水，PBS或者其他溶液洗去。可用于PVDF膜、硝酸纖維素膜 (NC膜)和醋酸纖維素膜上蛋白的檢測，不適用于尼龍膜上的蛋白檢測。
4.免疫印跡——接下來就是見證奇跡的時刻
A: 常見的封閉液有5%脫脂奶粉和BSA封閉液，磷酸化蛋白使用BSA作為封閉液， 脫脂奶粉會對磷酸化蛋白檢測有影響。
B: 封閉時間和封閉液劑量要足夠，封閉不充分顯色背景會過深；洗膜時間要適當，一般用TBST洗滌5min×3次，過度洗膜會使信號減弱；抗體的稀釋倍數按照產品說明書和實驗要求進行適當調整，抗體濃度不宜過高。
C: 顯色：一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法，A、B發光液按比例稀釋混合，現配現用。不同蛋白最佳曝光時間不同，如果同一張膜上不同樣品信號差異太大，可以嘗試將膜剪開再分別進行曝光。
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蛋白免疫印跡(WB)實驗流程及配套試劑
