最近，Bioss直標一抗促銷活動正如火如荼進行，其中有相當大一部分直標抗體屬于熒光標記抗體。為了幫助大家更好地使用熒光直標一抗，我們特地準備了這個小短文，供您參考。
對于熒光直標一抗，需要注意以下四點：
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1.選擇熒光標記要匹配熒光直標抗體的一個主要優勢在于它為多重檢測提供了機會，比如現在一些先進的流式細胞儀能檢測每個細胞中20多個離散參數。在設計多重實驗時，應考慮每種熒光基團的獨特性質，如最大吸收波長和最大發射波長，消光系數和斯托克斯位移等因素。
對于免疫熒光分析方法，人們要同時檢測組織或細胞樣本中的多個抗原，常常會利用直標一抗進行免疫熒光共染色，這時一般盡量選擇光譜重疊比較少的熒光基團進行組合。比如，我們會選擇一個AF488標記的抗體和另一個AF647標記的抗體進行兩個不同蛋白的共染色。
對于流式細胞分析方法，我們對同時檢測多個抗原所需的熒光抗體的選擇相對容易一些。由于在流式細胞實驗過程中，熒光抗體對單細胞懸液的標記效果直接影響實驗的數據質量。因此，需要考慮各種影響流式抗體品質及檢測效果的因素，例如抗體特異性、熒光素信號強弱、熒光素標記方式、同型對照等。首先，選擇流式熒光抗體一定要滿足最基本的條件：抗體有較好的目標蛋白特異性及適用的反應種屬。其次，要根據目標蛋白的豐度，選擇匹配的熒光素，來保證合適的熒光強度。如不同熒光標記在不同的儀器上強度不同，以FACS Calibur儀器為例：PE>APC>PE-Cy5>PerCP>FITC>PerCP-Cy5.5。通常來說，PE最強，適用于弱表達抗原。FITC強度較弱，適用于強表達抗原，使用范圍比較廣。用戶需根據檢測的目標蛋白進行具體選擇。如果同時檢測多個指標：確認流式細胞儀能檢測多少個通道：流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實驗者同時檢測三個指標，可以在下圖中綠色、黃色和紅色三個通道中各選一個適當的熒光素標記，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標選擇同一個通道的熒光標記，以防止熒光的重疊和相互干擾，影響最后結果。因此，流式細胞儀的通道越多，同一份樣本能同時做的表面/胞內標志就越多。常用熒光標記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。我們這邊提供如下表格，幫助大家進行熒光素的選擇。
2.熒光試劑保存要妥當
盡管許多熒光基團具有相對的光穩定性，但在保存和染色過程中若未能避光,則可能導致熒光基團-抗體結合物降解，引起假陰性結果。熒光物質必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護其光譜完整性。另外，串聯的熒光基團（如PE-Cy5）對頻繁操作引起的不穩定性特別敏感，大家要注意。
3.操作方案要優化
1.免疫熒光操作方案的優化
對于免疫熒光實驗，從細胞樣品處理、固定、通透、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。樣品制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，其質量對實驗的成敗至關重要，這一步關鍵的是玻片的處理以及細胞的活力。固定和通透步驟最重要的是根據所研究抗原的性質選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。封閉最好用與指標一抗相同來源種屬的正常血清來進行封閉。對于直標一抗的免疫熒光染色，我們需要考慮抗體的建議稀釋度，以實現高的信噪比。若抗體濃度過低，則熒光信號較弱，可能難以與背景區分開，但抗體濃度過高，則會導致較高的背景染色。另外，要注意各步驟之間的徹底洗滌的重要性，利用生理溶液來洗滌，可去除未結合的熒光試劑，或那些只是粘在目標上而非特異性結合的熒光試劑，從而提高信噪比。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。盡管免疫熒光技術提供了準確的結果，但也存在一些缺點，包括自發熒光、熒光信號的淬滅。因此，可以針對上述問題，利用一些免疫熒光專用細胞處理試劑去進行預處理，以減少自發熒光或熒光信號的淬滅。有關免疫熒光技術的詳細講解，可以通過點擊我們近期發布的其他軟文來查看詳情。
2.流式細胞術操作方案的優化
流式細胞術操作方案的優化，主要包括以下幾個方面：
選擇固定劑
（1）變性試劑：通過將蛋白變性再固定在細胞結構上的有機溶劑，如90%甲醇、70%乙醇等，變性試劑一般與細胞膜磷脂雙分子層有相互作用，因此同時具有破膜作用。如果采用變性試劑固定細胞，而抗體用來標記胞內蛋白，則不需要另外破膜。
（2）交聯試劑：通過自由氨基基團使蛋白分子交聯起來固定蛋白，如4%多聚甲醛、10%福爾馬林溶液等，如果采用交聯試劑固定細胞，而抗體用來標記胞內蛋白，則需要另外破膜。
優化抗體使用濃度
抗體滴定方法：用同種細胞，相同細胞數量與反應體積，加入不同量的抗體計算陽性峰熒光強度及信噪比（S/N>3）。
（1）滴定的濃度范圍盡量大，至少5個左右。
（2）滴定實驗條件要和實際實驗條件一致，如反應溫度、pH等。
（3）弱表達或不分群的抗原不適合做滴定。
封閉Fc受體
Fc受體是指細胞表面能夠與免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM、IgE和IgD）結合的分子，存在于NK 細胞、肥大細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的表面。FcR 能夠與抗體的Fc段結合，在檢測時產生假陽性。
（1）商品化的 Fc Block試劑：重組人 IgG，小鼠 CD16/CD32 抗體。
（2）人血清或相應物種的血清
排除死細胞
死細胞的自發熒光水平很高，且容易攝取抗體導致非特異性結合，最終影響實驗結果； 還可能會釋放DNA，DNA非常粘稠，會導致細胞成團，容易堵塞管路。
區分死細胞的方法
死細胞特性：細胞膜滲透性增強，失去膜完整性
（1）DNA結合染料：PI、DAPI、7-AAD、TO-PRO-3等DNA染料只會進入細胞膜受損的細胞，結合到細胞的DNA上,圖三門R3中為7-AAD陰性，即為活細胞。
（2）蛋白結合染料：結合細胞表面或膜內的游離胺，活細胞弱陽，死細胞強陽。可以用在固定標本中的，區分樣本固定細胞狀態。
4.要設立必要的對照
對于免疫熒光或流式細胞分析實驗，由于操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那樣可以根據分子量的大小區分非特異性識別，所以要得到一個可信的實驗結果，除了需要高質量的抗體，以及對實驗條件進行反復優化外，還必須設立嚴謹的實驗對照。對于熒光直標抗體，我們建議使用抗體的同型對照，即與抗體同一個來源種屬的正常同型IgG作為對照，對樣品進行平行染色，來確定抗體的染色是否特異。此外，我們還可以使用不表達目標的細胞或組織作為陰性樣品對照。同時，為了確保所有組分都正常發揮作用，那些已知表達目標的陽性對照也少不了。
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活動時間：2019年7月15日至2019年10月31日。
活動規則：4. Bioss樣本庫樣本與研究者樣本一致，即可在3個工作日內發貨，寄送樣本者需等待7-10個工作日。
5. 細胞樣本僅接受北京地區寄送，組織樣本接受全國寄送，不接受到付樣本。
6. 寄到Bioss要求匹配驗證的樣本不予寄回, 請客戶填寫清楚實驗信息。
活動申請表單鏈接：
直標一抗試用裝申請表單
直標一抗試用裝反饋表單
以上活動最終解釋權歸Bioss所有！
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