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Bioss流式講堂｜多色搭配大師懂這些就夠了

發(fā)表者：北京博奧森生物發(fā)表時(shí)間：2018-10-30

知識(shí)要點(diǎn)：熒光標(biāo)記的流式抗體種類繁多，熒光素的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜各異，給抗體選擇、熒光搭配等帶來(lái)了諸多困擾。需要注意：熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)需要與可激發(fā)發(fā)光的激光器匹配，熒光素的激發(fā)光譜峰值盡可能接近儀器激光的激發(fā)光波長(zhǎng)。此外，熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)必須選用相應(yīng)波段檢測(cè)器接收，以達(dá)到同時(shí)檢測(cè)的目的。

熒光素的搭配依據(jù)

流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個(gè)因素決定：流式細(xì)胞儀檢測(cè)的通道數(shù)、需要同時(shí)檢測(cè)的熒光抗體數(shù)、廠家抗體的熒光種類及數(shù)目。
（1）激光管數(shù)目以及每根激光的功能決定檢測(cè)的通道數(shù)量，即可同時(shí)檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)量。注意以下兩點(diǎn)：
① 流式細(xì)胞儀有哪些激光。比如標(biāo)配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1/ FL2/ FL3三個(gè)顏色；而選配的FACSCalibur配有488nm和635nm兩根激光，能做FL1/ FL2/ FL3/ FL4四個(gè)顏色。
② 不同型號(hào)的儀器同一通道檢測(cè)熒光素的能力是不一樣的，比如FACSCalibur的FL3能檢測(cè)PE-Cy5/PerCP/PerCP-Cy5.5/PE-Cy7，而Aria只能檢測(cè)PE-Cy5/PerCP。

（2）需要同時(shí)檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)量超過(guò)了儀器能力范圍：拆開分管標(biāo)記。如下例，

計(jì)劃?rùn)z測(cè)5個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只有4個(gè)通道，首先將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測(cè)。如同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

（3）廠家提供的熒光素種類及數(shù)目：供應(yīng)商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的。盡量選擇說(shuō)明書中有流式圖的抗體。

不同型號(hào)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)通道及可應(yīng)用的熒光素^[1]

熒光素搭配原則:
（1）根據(jù)儀器選擇熒光素
① 每個(gè)通道只能選擇一個(gè)熒光素
以calibur為例，F(xiàn)L1選擇了FITC就不能選擇AlexaFluor488; FL3可檢測(cè)PE-Cy5 / PerCP / PerCP-Cy5.5等5種熒光，但熒光搭配時(shí)只能選擇一種熒光被此接收器檢測(cè)。
② 各通道之間熒光素可隨意搭配
如果流式細(xì)胞儀有4個(gè)通道，每個(gè)通道選出1個(gè)熒光素就可以組成4個(gè)顏色。
（2）搭配的熒光素之間發(fā)射光譜重疊盡量小
熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)相差越大，熒光重疊就越小，這是由熒光光譜特征決定的。另外，不建議聯(lián)用APC和Cy5串聯(lián)熒光，因?yàn)樗麄冎g光譜重疊較大，熒光補(bǔ)償不易調(diào)節(jié)。

4色以內(nèi)流式分析熒光素抗體組合

PerCP

FITC、PE

PE-Cy5

FITC、PE

PE-Cy5.5

FITC、PE、APC

PE-Cy7

FITC、PE、APC

6色、8色、10色流式分析熒光素抗體組合

6色	8色	10色
FITC或Alexa Fluor 488	FITC FITC 或Alexa Fluor 488	FITC或Alexa Fluor 488
PE	PE	PE
		PE-Texas Red或PE- Alexa Fluor610
PerCP-Cy5.5	PerCP-Cy5.5	PerCP-Cy5.5
PE-Cy7	PE-Cy7	PE-Cy7
APC或Alexa Fluor647	APC 或 Alexa Fluor647	APC 或 Alexa Fluor647
		APC或Alexa Fluor680或Alexa Fluor700
APC-Cy7或APC-H7	APC-Cy7或APC-H7	APC-Cy7或APC-H7
	AmCyan或BD Horizon V500	AmCyan或BD Horizon V500
	BD Horizon V450	BD Horizon V450

熒光選擇注意事項(xiàng):
1.選擇熒光素應(yīng)考率的因素
① 抗原密度：高表達(dá)抗原可以選擇任何熒光素標(biāo)記的抗體檢測(cè)，低表達(dá)的抗原需要用較量熒光素（如PE/APC）標(biāo)記的抗體檢測(cè)，從而達(dá)到有效區(qū)分陰性細(xì)胞和陽(yáng)性細(xì)胞的目的。
② 降低自發(fā)熒光：選擇高波長(zhǎng)范圍里的熒光染料，自發(fā)光在高波長(zhǎng)范圍里（＞600nm）迅速降低。

2.應(yīng)用FITC標(biāo)記抗體避免使用酸性緩沖液
應(yīng)用FITC標(biāo)記抗體時(shí)，避免使用酸性緩沖溶液，因?yàn)镕ITC的熒光特性是PH依賴性的。

3.串聯(lián)染料確保未發(fā)生解偶聯(lián)
串聯(lián)染料有可能會(huì)發(fā)生解偶聯(lián)，對(duì)“光漂白”和使用固定劑的“固定時(shí)間”更加敏感。建議設(shè)置一個(gè)“串聯(lián)染料單染”作為對(duì)照，并在其他通道檢測(cè)熒光的情況作為對(duì)比，以確保未發(fā)生解偶聯(lián)。例如，應(yīng)用PE/Cy5單染做對(duì)照時(shí)，分析PE通道的熒光信號(hào)。
[1] 劉艷榮. 實(shí)用流式細(xì)胞術(shù). 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2017（3-39）.

PerCP	FITC、PE
PE-Cy5	FITC、PE
PE-Cy5.5	FITC、PE、APC
PE-Cy7	FITC、PE、APC

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